Grössenausschlusschromatographie SEC

 

 

 

1.       Ziel des Versuchs

 

Bei der SEC werden die Substanzen aufgrund ihres hydrodynamischen Volumens getrennt. Über die Erstellung einer Kalibriergeraden aus den Retentionszeiten von Standardsubstanzen bekannter Masse wird die Masse einer unbekannten Substanz ermittelt.

 

 

 

2.       Theorie

 

Schlagworte:

Size Exclusion Chromatographiy (SEC) - Gelfiltrationschromatographie (GFC)  -  Prinzip der Trennung – Elutionsreihenfolge – Ausschlussvolumen/ Zwischenkornvolumen – Totvolumen/Gesamtvolumen - KSEC/scheinbarer Verteilungskoeffizient - Permeationsgrenze - Ausschlussgrenze

 

 

 

3.       Versuchsdurchführung

 

Von dem Assistent/der Assistentin wird ausgegeben:

Standardlösung a: 0,375mg Blue Dextran und 7,5mg BSA, es wird in 1,5ml Tris-Puffer 0,1mol gelöst

Standardlösung b:1,5mg Cytochrom C und 7,5mg Alkoholdehydrogenase werden in 1,5ml Tris-Puffer 0,1mol gelöst

Probelösung: Die unbekannte Substanz wird ebenfalls in 1,5ml 0,1mol Tris-Puffer gelöst

 

 

Geräteaufbau

 

 

 

 

Einstellungen am Computer

Das Messprogramm IPMB Visualizer läuft unter Windows XP.

Die Daten können über das WLAN Netz auf andere Computer verschoben und dort ausgewertet werden.

 

 

Andere Einstellungen

Die Einstellung der Flussrate wird von der Assistentin/dem Assistent vorgenommen (1,0 ml/min) und während des Laufes nicht verändert.

 

 

Funktion der Einspritzanlage

 

INJECT-Stellung: FließmittelàProbenschleifeàSäule (Transportieren der Probe auf die Säule)

LOAD-Stellung: Fließmittel àSäule (Probe kann in Loop injiziert werden, bzw. Loop kann gespült werden)

 

 

Vorgehensweise:

 

Der Hebel am Injektor wird auf „load“ gestellt und der Loop mit 1,0 M Tris-Puffer gespült. Dann wird die Probesubstanz in eine Spritze aufgezogen und in den Loop appliziert.

 

 

 


 

 

 

 

 

 

4.       Auswertung

 

Mit Hilfe der bekannten molaren Massen der Standardkomponenten soll durch logarithmisches Auftragen der Molmassen gegen die Retentionszeiten die molare Masse der unbekannten Probe bestimmt werden.

 

Zur Auswertung ist zu beachten, um welche Säule es sich handelt, z.B. Sephacryl S200-Säule, welche in der Lage ist, Molekülmassen zwischen 5.000 und 250.000 g/mol aufzutrennen.

Dementsprechend sind die Daten auszuwählen, die für die Kalibriergerade verwendet werden. Die Maxima der Peaks können direkt aus den Daten abgelesen werden oder aus einem in Excel erstellten Diagramm.

Die Masse der unbekannten Probe kann entweder graphisch von Hand bestimmt werden oder mathematisch über die Gleichung der Eichgeraden.